问题 | 原因 | 解决办法 |
DNA完全没有被内切酶切割 | 1)内切酶失活 | 标准底物检测酶活性 |
2)DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子 | 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA |
3)条件不适（试剂、温度） | 检查反应系统是否最佳 |
4)DNA酶切位点上的碱基被甲基化 | 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 |
5)DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I） | 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3AI代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 |
6)DNA位点上存在其它修饰 | 将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证 |
7)DNA不存在该酶识别顺序 | 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证 |
DNA切割不完全 | 1)内切酶活性下降 | 用5-10倍量过量消化 |
2)内切酶稀释不正确 | 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 |
3)DNA不纯，反应条件不佳 | 同上 |
4)内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 | 同上 |
5)部分DNA溶液粘在管壁上 | 反应前离心数秒 |
6)内切酶溶液粘度大，取样不准 | 将内切酶稀释，增大取样体积 |
7)酶切后DNA粘末端退火 | 电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷 |
8)由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 | 使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡 |
9)过度稀释使酶活性降低 | 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 |
10)反应条件不适 | 使用最佳反应体系 |
11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 | 加大酶量5-10倍 |
DNA片段数目多于理伦值 | 1)内切酶星状活性 | 检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量 |
2)其它内切酶污染 | 用λDNA作底物检查酶切结果 |
3)底物中含其它DNA杂质 | 电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段 |
酶切后没有观察到DNA片段的存在 | 1)DNA定量错误（如RNA含量较高） | 用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量 |
2)在酶切反应液中形成非特异的沉淀 | 在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次 |
内切酶保存期内快速失活 | 1)保存温度不合适 | 内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存 |
2)以稀释形式保存 | 稀释酶液不宜长期存放，应一次使用 |
3)贮藏缓冲液不适当 | 使用厂家推荐的贮藏缓冲液 |
4)低蛋白浓度 | 内切酶与500ug/ml的BSA一起保存 |
电泳后DNA片段的带型弥散，不均一 | 1)DNA上结合有蛋白质 | 电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化 |
2)内切酶中含有DNA外切酶 | 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶 |
酶切后的DNA片段连接效率低 | 1)含磷酸盐的浓度高 | 透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 |
2)内切酶失活不全或含有ATP酶 | 延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA |
3)平末端连接 | 加大T4 DNA Ligase用量 |
4)外切酶污染 | 减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA |
5)连接缓冲液不合适 | 重新配制连接缓冲液 |
三、DNA分子量标准问题分析：
问题 | 原因 | 解决办法 |
带弱或无DNA带 | 1)上样DNA的量不够 | 增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高 |
2)DNA降解 | 避免DNA的核酸酶污染 |
3)DNA走出凝胶 | 减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 |
4)对于EB染色的DNA，所用紫外光源不合适 | 应用短波长（254nm），紫外灯增强灵敏度 |
DNA带缺失 | 1)小DNA带走出凝胶 | 减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 |
2)分子大小相近的DNA带不易分辨 | 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度 |
3)DNA 变性 | 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaClBuffer稀释DNA |
4)巨大DNA链，凝胶电泳不合适 | 在脉冲电声凝胶电泳上分析 |
DNA带模糊 | 1)DNA降解 | 避免核酸酶污染 |
2)DNA上样量过多 | 减少凝胶中DNA上样量 |
3)所用电泳条件不合适 | 电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 |
4)DNA样含盐过高 | 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 |
5)有蛋白污染 | 电泳前酚抽提去除蛋白 |
6)DNA变性 | 电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA |
不规则DNA带迁移 | 1)对于λ/Hind III片段COS位点复性 | 电泳前加热DNA 65℃加热5-10分钟，然后在冰上冷却5分钟 |
2)电泳条件不合适 | 电泳电压不超过20V/cm，温度＜30℃，电泳缓冲液有足够的缓冲能力 |
3)DNA变性 | 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热 |
以λ/HindIII为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准，会发现电泳后分子量条带不对的问题，解释原因如下：在LambdaDNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点，COS位点的退火复性，在λDNA片段电泳分离时会出现问题，含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到，而复性的左右臂片段会结合成大的片段，即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带，这就造成了不正常的带型。解决以上问题的办法，是在电泳之前，把DNA分子量标准67℃加热约10分钟，然后立即放入冰浴中骤冷，待样品冷却后上样。这样即可解离复性的粘性末端，使电泳过程DNA片段形成正常的带型分布。
四、凝胶电泳操作注意事项：
1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。
6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。